你的WesternBlot条带为什么
WesternBlot
WB条带异常解决办法
前言
WesternBlot即蛋白免疫印迹，简称为WB,是将细胞或组织总蛋白质通过电泳从凝胶转移到固相支持物NC膜（硝酸纤维素薄膜）或PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的技术。
我们搜集了WB中常见的异常条带，并分析失误原因，列出了解决方法，希望能对大家有所帮助。
PART01
无背景无条带（白片）
原因：最可能是一抗失效，或者二抗种属出错，比如兔（Rb）加成大鼠（Ra）。
解决办法：
1、目的蛋白完全没有信号，但同时做的内参是正常的，那么大部分情况是一抗抗体失效或者用错二抗。
2、目的蛋白完全没有信号，内参也没有信号，则考虑是否发光液失效。如果膜上没有marker则为转膜失败。
3、如果中间出现了细微的条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低。
PART02
高背景（均一弥漫性）
原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
解决办法：高背景是WB中最常见出现的问题。如图目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数（5min*5次或者10min*3次）。如不能解决，可重新封闭。
PART03
出现非均一性背景
原因：膜可能曾经干过。
解决办法：转膜结束后的封闭，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。另外，夹取膜时，尽量用镊子夹取Marker所在位置，以防刮伤刮坏蛋白样。
PART04
出现黑点和黑斑
原因：封闭液未完全溶解
解决办法：封闭牛奶一定要充分溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。封闭结束之后PBST清洗1-3遍之后可有效解决。
PART05
非特异性条带（杂带）
原因：一抗非特异性与蛋白结合，多克隆抗体易发生。
解决办法：更换一抗或降低一抗浓度。此种情况绝大多数是因为一抗特异性太差，或者是一抗浓度太高引起的非特异性结合。如果无法判断哪一条是目的条带，又实在没有更好的抗体，建议增加阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
PART06
条带有边缘规则的白圈
原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡。转模时把电泳胶用纯水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡。然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。放上滤纸后，用滚轮稍微贴实下，然后盖上海绵。注意滚气泡时不要来回赶，这样反而会带入气泡。
PART07
条带中有白色（反白）
原因：中心部位高浓度酶把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了。
解决办法：快速曝光，在中间部位底物消耗之前拍照成功。如果不行，建议降低蛋白量，降低一抗二抗浓度。
PART08
条带拖尾
原因：蛋白量太大或轻微降解，一抗浓度过高或时间太长。
解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以降低。一般来说，蛋白量都是经过测试和预实验摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。如果经重复确定是蛋白降解，那么需要重新提取蛋白。
PART09
某个条带变形
原因：SDS-PAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液均要注意不要有杂质。
PART10
条带呈哑铃状
原因：配置胶凝固不均一。
解决办法：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一。如果如图中示意拔完梳子之后梳孔不平整，那么条带多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有完全离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。可以离心后上样。
PART11
最边缘条带弯曲
原因：电泳电流不均一。
解决办法：换用新的电泳槽；或尽量不使用两边的两孔，两端加1*Loading压样。上样最好在胶的中间，中间电场最均一。
PART12
其他问题
（1）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
（2）整个条带呈“︵”状：凝胶冷却不均一。
（3）电泳时溴酚蓝拖尾：样品混合不均一。
（4）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短。
（5）有纵向纹理：上样样品中存在不溶性颗粒
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总结
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如果是条带“形状”的问题，主要集中在“样品制备”和“配胶、电泳”环节，与“转膜”和“免疫检测”基本没有任何关系。
“样本制备”的问题，主要集中在样本可能出现降解，样本没有完全溶解，加样不合适等；
“配胶和电泳”主要集中试剂可能过期，没有正确保存，成胶时间过快，胶没有完全凝好，电泳液时间过长，电流或电压不合适等；
END
往期回顾
干货
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